Ezio kehrt zurück und kämpft gegen den mächtigen Templerorden. Als legendärer Meisterassassine muss er nun nach Rom reisen, dem Zentrum von Macht, Gier und Korruption, um das Herz des Feindes zu treffen. Ezio wird eine ganze Bruderschaft anführen, die sich ihm anschließen wird, und nur durch gemeinsames Arbeiten können die Assassinen ihre tödlichen Feinde besiegen.

Assassin's Creed Brotherhood bietet auch ein völlig innovatives Mehrspieler-Element, bei dem die Spieler den Templern helfen können, indem sie Abstergo nutzen, um sich in der Kunst des Attentats auszubilden, um die Assassinen ein für alle Mal zu eliminieren. Die Spieler haben die Möglichkeit, aus einer Reihe einzigartiger Charaktere zu wählen - jeder mit seinen eigenen Waffen und unterschiedlichen Attentatstechniken - und ihre Fähigkeiten in verschiedenen Spielmodi gegen andere Spieler aus der ganzen Welt zu kombinieren.